KROMATOGRAFI

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan. Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati kolom yang merupakan fase diam. Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan kolom akan cenderung bergerak lebih lambat dibanding molekul yang berikatan lemah. Dengan ini, berbagai macam tipe molekul dapat dipisahkan berdasarkan pergerakan pada kolom.

Setelah komponen terelusi dari kolom, komponen tersebut dapat dianalisis dengan menggunakan detektor atau dapat dikumpulkan untuk analisis lebih lanjut. Beberapa alat-alat analitik dapat digabungkan dengan metode pemisahan untuk analisis secara on-line (on-line analysis) seperti: penggabungan kromatografi gas (gas chromatography) dan kromatografi cair (liquid chromatography) dengan mass spectrometry (GC-MS dan LC-MS), Fourier-transform infrared spectroscopy (GC-FTIR), dan diode-array UV-VIS (HPLC-UV-VIS

Jenis Kromatografi

Kromatografi Cair (Liquid Chromatography)

Kromatografi cair merupakan teknik yang tepat untuk memisahkan ion atau molekul yang terlarut dalam suatu larutan. Jika larutan sampel berinteraksi dengan fase stasioner, maka molekul-molekul didalamnya berinteraksi dengan fase stasioner; namun interaksinya berbeda dikarenakan perbedaan daya serap (adsorption), pertukaran ion (ion exchange), partisi (partitioning), atau ukuran. Perbedaan ini membuat komponen terpisah satu dengan yang lain dan dapat dilihat perbedaannya dari lamanya waktu transit komponen tersebut melewati kolom. Terdapat beberapa jenis kromatografi cair, diantaranya: reverse phase chromatography, High Performance Liquid Chromatography (HPLC), size exclusion chromatography, serta supercritical fluid chromatography.

Reverse phase chromatography

Reverse phase chromatography merupakan alat analitikal yang kuat dengan memadukan sifat hidrofobik serta rendahnya polaritas fase stasioner yang terikat secara kimia pada padatan inert seperti silika. Metode ini biasa digunakan untuk proses ekstraksi dan pemisahan senyawa yang tidak mudah menguap (non-volatile).

High performance liquid chromatography

High performance liquid chromatography (HPLC) mempunyai prinsip yang mirip dengan reverse phase. Hanya saja dalam metode ini, digunakan tekanan dan kecepatan yang tinggi. Kolom yang digunakan dalam HPLC lebih pendek dan berdiameter kecil, namun dapat menghasilkan beberapa tingkatan equilibrium dalam jumlah besar.

Size exclusion chromatography

Size exclusion chromatography, atau yang dikenal juga dengan gel permeation atau filtration chromatography biasa digunakan untuk memisahkan dan memurnikan protein. Metode ini tidak melibatkan berbagai macam penyerapan dan sangat cepat. Perangkat kromatografi berupa gel berpori yang dapat memisahkan molekul besar dan molekul kecil. Molekul besar akan terelusi terlebih dahulu karena molekul tersebut tidak dapat penetrasi pada pori-pori

Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu analisis kualitatif dari suatu sampel yang ingin dideteksi dengan memisahkan komponen-komponen sampel berdasarkan perbedaan kepolaran.

Prinsip

Prinsip kerjanya memisahkan sampel berdasarkan perbedaan kepolaran antara sampel dengan pelarut yang digunakan. Teknik ini biasanya menggunakan fase diam dari bentuk plat silika dan fase geraknya disesuaikan dengan jenis sampel yang ingin dipisahkan. Larutan atau campuran larutan yang digunakan dinamakan eluen. Semakin dekat kepolaran antara sampel dengan eluen maka sampel akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut.

Visualisasi

Proses berikutnya dari kromatografi lapis tipis adalah tahap visualisasi. Tahapan ini sangat penting karena diperlukan suatu keterampilan dalam memilih metode yang tepat karena harus disesuaikan dengan jenis sampel yang sedang di uji. Salah satu yang dipakai adalah penyemprotan dengan larutan ninhidrin. Ninhidrin (2,2-Dihydroxyindane-1,3-dione) adalah suatu larutan yang akan digunakan untuk mendeteksi adanya gugus amina. Apabila pada sampel terdapat gugus amina maka ninhidrin akan bereaksi menjadi berwarna ungu. Biasanya padatan ninhidirn ini dilarutkan dalam larutan butanol.

Nilai Rf

Jarak antara jalannya pelarut bersifat relatif. Oleh karena itu, diperlukan suatu perhitungan tertentu untuk memastikan spot yang terbentuk memiliki jarak yang sama walaupun ukuran jarak plat nya berbeda. Nilai perhitungan tersebut adalah nilai Rf, nilai ini digunakan sebagai nilai perbandingan relatif antar sampel. Nilai Rf juga menyatakan derajat retensi suatu komponen dalam fase diam sehingga nilai Rf sering juga disebut faktor retensi. Nilai Rf dapat dihitung dengan rumus berikut :

Rf = Jarak yang ditempuh substansi/Jarak yang ditempuh oleh pelarut

Semakin besar nilai Rf dari sampel maka semakin besar pula jarak bergeraknya senyawa tersebut pada plat kromatografi lapis tipis. Saat membandingkan dua sampel yang berbeda di bawah kondisi kromatografi yang sama, nilai Rf akan besar bila senyawa tersebut kurang polar dan berinteraksi dengan adsorbent polar dari plat kromatografi lapis tipis.

Nilai Rf dapat dijadikan bukti dalam mengidentifikasikan senyawa. Bila identifikasi nilai Rf memiliki nilai yang sama maka senyawa tersebut dapat dikatakan memiliki karakteristik yang sama atau mirip. Sedangkan, bila nilai Rfnya berbeda, senyawa tersebut dapat dikatakan merupakan senyawa yang berbeda.

Kromatografi  kertas merupakan salah satu metode pemisahan berdasarkan distribusi suatu senyawa pada dua fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak. Pemisahan sederhana suatu campuran senyawa dapat dilakukan dengan kromatografi kertas, prosesnya dikenal sebagai analisis kapiler dimana lembaran kertas berfungsi sebagai pengganti kolom.


Kromatografi kertas adalah salah satu pengembangan dari kromatografi partisi yang menggunakan kertas sebagai padatan pendukung fasa diam. Oleh karena itu disebut kromatografi kertas. Sebagai fasa diam adalah air yang teradsorpsi pada kertas dan sebagai larutan pengembang biasanya pelarut organik yang telah dijenuhkan dengan air.

Dalam kromatografi kertas fasa diam didukung oleh suatu zat padat berupa bubuk selulosa. Fasa diam merupakan zat cair yaitu molekul H2O yang teradsorpsi dalam selulosa kertas.fasa gerak berupa campuran pelarut yang akan mendorong senyawa untuk bergerak disepanjang kolom kapiler. Analisis kualitatif menggunakan kromatografi kertas dilakukan dengan cara membandingkan harga relative response factor (Rf). Nilai Rf identik dengan time retention (tR) atau volume retention (VR).

Nilai Rf dapat ditentukan dengan cara:

Rf = jarak yang ditempuh noda

jarak yang ditempuh pelarut

Harga Rf zat baku dapat diidentifikasikan komponen campuran, karena harga besaran ini bersifat khas untuk setiap zat asal digunakan jenis pengembang yang sama. Kadang-kadang pemisahan dalam satu arah belum memberikan hasil yang memuaskan. Untuk mendapatkan hasil yang lebih baik, dapat dipakai cara kromatografi kertas dua dimensi, yang mana letak kertas diubah sehingga arah pemisahan juga berubah.

Secara umum kromatografi kertas dilakukan dengan menotolkan larutan yang berisi sejumlah komponen pada jarak 0,5 sampai 1cm dari tepi kertas. Setelah penetesan larutan pada kertas, maka bagian bawah kertas dicelupkan dalam larutan pengambang(developing solution). Larutan ini umumnya terdiri atas campuran beberapa pelarut organik yang telah dijenuhkan dengan air.

Sistem ini akan terserap oleh kertas dan sebagai akibat dari gaya kapiler akan merambat sepanjang kertas tersebut. Rambatan ini dapat diusahakan dalam modus naik atau menurun. Selama proses pemisahan dilakukan, sistem secara keseluruhannya disimpan dalam tempat tertutup, ruang didalamnya telah jenuh dengan uap sistem pelarut ini.

 “Kromatografi merupakan suatu proses pemisahan yang mana analit-analit dalam sampel terdistribusi antara 2 fase, yaitu fase diam dan fase gerak.”
Dari pengertian di atas dapat diketahui kalo ada dua komponen penting dalam kromatografi yaitu fase diam dan fase gerak. Dan perlu dicatat bahwa hasil pemisahan kromatografi yang baik bukan lagi berbentuk senyawa melainkan berbentuk tunggal.
Fase diam (Stationary phase)
Fase diam merupakan salah satu komponen yang penting dalam proses pemisahan dengan kromatografi. kenapa? karena dengan adanya interaksi dengan fase diamlah terjadi perbedaan waktu retensi (tR) dan terpisahnya komponen senyawa analit.
Fase diam dapat berupa bahan padat atau porous (berpori) berbentuk molekul kecil atau cairan yang umumnya dilapiskan pada padatan pendukung.
Fase gerak (Mobile phase)
Fase gerak merupakan pembawa analit dapat bersifat inert maupun berinteraksi dengan analit tersebut. Nah fase gerak ini g melulu hanya cairan. Tapi juga dapat berupa gas inert yang umumnya dapat dipakai sebagai carrier gas senyawa mudah menguap (volatil)
Pemisahan dengan kromatografi
Pemisahan dengan kromatografi sendiri lebih baik daripada ekstraksi. kenapa? Karena sering diibaratkan dengan corong pisah yang saling berhubungan yang bergerak dari atas ke bawah dimana pada setiap corong pisah terjadi pemisahan. Selain itu permukaan antar fase pada kromatografi lebih besar.
Lalu apa yang menyebabkan senyawa tersebut dapat dipisahkan?
Seperti yang telah dijelaskan sebelumnya kalo pemisahan senyawa-senyawa dapat diamati dengan perbedaan waktu retensi (tR) pada kromatogram.
“Waktu retensi (tR) adalah waktu yang diperlukan oleh analit dari awal kolom sampai ke detektor”
Semakin lama analit berinteraksi dengan fase diam –> semakin lama ia keluar –> tR semakin besar
Sehingga ada suatu konstanta yang menyatakan kecepatan migrasi solut melalui fase diam. Kecepatan migrasi solut dipengarui oleh perbandingan distribusinya (Kd atau kadang disebut D) yang ditentukan oleh afinitas relatif solut pada fase diam dibanding fase gerak:
Kd = Kadar senyawa dalam fase diam/Kadar senyawa dalam fase gerak
Dari persamaan tersebut dapat ditarik kesimpulan kalo semakin besar harga Kd suatu senyawa maka waktu retensinya (tR) akan semakin besar karena interaksi dengan fase diam besar dan migrasinya semakin lambat.

Interaksi Analit dan Fase diam

Setelah tahu tentang konsep pemisahan nyambung kesini. Sebenarnya secara sederhana mekanisme pemisahan analit dibedakan menjadi 4, hal ini yang mengakibatkan perbedaan waktu retensi karena perbedaan interaksi analit dengan fase diamnya.
1. Adsorbsi
Fase diam: Padatan
Fase gerak: Cair (bisa juga gas pada Kromatografi padat-gas)
Dasar pemisahan: Stereokimia

2. Partisi
Fase diam: Cair
Fase gerak: Cair atau gas (pada kromatografi cair-gas)
Dasar pemisahan: Partisi-konsep like dissolves like
Untuk kromatografi jenis ini dasarnya adalah senyawa yang memiliki kemiripan sifat fisika kimia dengan fase diam akan tertambat lebih lama pada fase diam –> tR lebih besar
Sebagai contoh jika kita ingin memisahkan kafein dan parasetamol pada sampel obat flu (kaya praktikum HPLC hehe) dengan fase diam ODS (Oktadesil silika) yang nonpolar. maka parasetamol akan lebih dulu keluar dari kolom atau tR lebih kecil daripada kafein. karena Kafein sifatnya nonpolar dan lebih terlarut pada fase diam. sedangkan parasetamol bisa terlarut dikit tp cuma sebentar.

3.  Penukar ion (bahasa kerennya: ion exchange)
mekanisme pemisahan karena interaksi ionik antara fase diam dan solut. biasanya dipake di pabrik farmasi untuk bikin air bebas ion (sori lupa namanya haha). berdasarkan muatan yang dilapiskan pada fase diam, dapat dibagi 2:
a. Penukar anion: Fase diamnya muatan positif sehingga yang bermuatan negatif akan ketarik fase diam
b. Penukar kation: Fase diamnya bermuatan negatif sehingga yang bermuatan positif akan ketarik fase diam

4. Ekslusi ukuran (bahasa kerennya: Size Exclusion Chromatography)
Prinsip kerjanya pemisahan analit berdasarkan ukuran. Biasanya pake fase diam dengan pori berukuran tertentu.
Jadi ntar saat elusi, molekul yang kecil akan masuk ke pori fase diam. semakin kecil maka dapat masuk semakin dalam. sedangkan molekul yg besar dia g bisa masuk ke pori sehingga langsung terelusi.
Kesimpulannya: Partikel dengan ukuran besar (BM besar) memiliki tR lebih kecil daripada partikel dengan ukuran kecil (BM kecil)

Pelebaran puncak kromatogram
Selesai dipisahkan di kolom, dibawa ke detektor dan dicetak oleh rekorder maka kita dapat yang namanya kromatogram. Secara resmi yg ada di buku B) kromatogram merupakan profil konsentrasi yang simetri dalam arah aliran fase gerak (?)
gampangnya sih yang sumbu x itu waktu, sumbu y signal yg diterima detektor
Kromatogram yang ideal alias yg bagus yaitu yang tinggi, ramping dan tidak saling tindih antar satu puncak dengan lain. Namun kadang (bahkan sering sih) terjadi pelebaran puncak kromatogram. Apa aja penyebabnya:
1. Eddy diffusion
Kolom kan dikemas pake partikel fase diam yang kecil. Trus fase gerak lewat sambil bawa analit. Nah ada beberapa analit yang bisa lewat dengan mudah trus sampe detektor daripada beberapa partikel yang mengalami pengalihan (diversi) karena jalannya belok2. Buat lebih jelasnya liat di gambar:

Di gambar di atas kan bisa dilihat bahwa partikel B “beruntung” jalan yg dilewati tiada hambatan. ia tinggal lurus tanpa susah-susah. Beda dengan A dan C. Mereka berdua harus susah payah nglewatin halangan rintangan partikel fase diam. Partikel C halangannya lebih sedikit dari partikel B sehingga nyampe ke detektor setelah A. Sedangkan A harus belok jauh nyari jalan baru bisa nyampe.
Untuk meminimalkannya dengan pake kolom dengan partikel yang homogen densitasnya
2. Longitudinal diffusion
Biasanya terjadi jika kecepatan alir fase gerak lambat. Pada keadaan tersebut, aliran fase gerak dengan analit di yang dekat dengan fase diam akan lambat karena adanya Vander walls force sedangkan yang berada di tengah lebih cepat alirannya namun konsentrasinya lebih kecil daripada yang samping. Karenanya analit yang semula tertahan oleh gaya Vanderwalls di samping akan berdifusi ke tengah sesuai dengan hukum Ficks.
Cara meminimalkannya: mempercepat laju alir dan menurunkan temperatur.
3. Mass transfer equilibrum
Kalo yang ini biasanya terjadi kalo laju alir terlalu cepat dan pemisahan pada kolom belum tercapai sempurna.
Cara meminimalkannya:
a. pake partikel kecil, karena luas permukaan besar sehingga kesetimbangan cepat tercapai
b. Menaikkan temperatur
c. Laju alir diperlambat
Jika faktor-faktor tersebut dibuat suatu kurva dengan H(tinggi lempeng teoritis) sebagai sumbu y dan V (kecepatan alir) sebagai sumbu x, maka akan didapat kecepatan alir optimum. Kurva ini disebut dengan kurva Van deemter.
Kurva van deemter ini didapat dari persamaan van deemter:
H = A+B/u+Cu
dimana A merupakan konstanta difusi eddy, B merupakan konstanta difusi longitudinal, C merupakan konstanta transfer massa, dan u merupakan laju alir fase gerak.
Dari persamaan tersebut dapat dilihat bahwa efisiensi pemisahan pada kromatografi bergantung pada ketiga faktor diatas, dan pelebaran puncak yang disebabkan oleh difusi longitudinal dan transfer massa bergantung pada laju alir fase gerak (seperti yang sudah dijelaskan sebelumnya). Karenanya dari kurva van deemter dapat diperoleh laju alir fase gerak yang optimum.
Sedangkan makin rendah resultan –> HETP makin rendah efisiensi kolom lebih baik.
Kenapa?
Karena ada rumus lagi yaitu:
Jumlah lempeng teoritis = Panjang kolom / HETP (lebar lempeng teoritis)
atau
N = L / HETP
Efisiensi kolom meningkat jika N / jumlah lempeng teoritis meningkat. Kenapa? Karena semakin banyak lempeng teoritis maka pemisahan semakin baik (diumpamakan semakin banyak pula corong pisahnya ekstraksinya lebih baik). Semakin panjang L (panjang kolom) maka semakin banyak jumlah lempeng teoritis dan efisiensi semakin bagus.
Namun bila HETP lebih besar efisiensi kolom jelek. kenapa? Karena berarti lebar untuk 1 kolom teoritis lebih besar sehingga dalam kolom yg panjangnya sama, jumlah lempeng teoritisnya lebih sedikit. Misalnya ada dua kolom, dimana panjang kolom (L) nya sama2 100 cm. Kolom 1 HETPnya 5 cm sedangkan kolom 2 HETPnya 10 cm. Berarti dalam kolom 1 ada 20 lempeng teoritis kan (dari 100/5) ? lebih besar daripada di kolom 2 yg lempeng teoritisnya cuma 10